Активация

Биология связи, том 6, Номер статьи: 604 (2023) Цитировать эту статью

1 Альтметрика

Подробности о метриках

CAR-Т-клеточная терапия — быстро развивающаяся область онкологического лечения, имеющая потенциал стать стандартом лечения по множеству показаний. По совпадению, технология редактирования генов CRISPR/Cas внедряется в производство продуктов CAR T-клеток следующего поколения, обещая более точную и более контролируемую методологию модификации клеток. Пересечение этих медицинских и молекулярных достижений открывает возможность для совершенно новых способов создания модифицированных клеток, которые помогут преодолеть текущие ограничения клеточной терапии. В этой рукописи мы представляем данные для проверки концепции спроектированной петли обратной связи. Мы произвели индуцируемые активацией CAR T-клетки с помощью направленной интеграции, опосредованной CRISPR. Этот новый тип сконструированных Т-клеток экспрессирует ген CAR в зависимости от статуса их активации. Это изобретение открывает новые возможности регулирования функции CAR Т-клеток как in vitro, так и in vivo. Мы считаем, что такая система физиологического контроля может стать мощным дополнением к доступному в настоящее время набору инструментов CAR-конструкций следующего поколения.

Генно-инженерные Т-клетки, экспрессирующие модифицированный Т-клеточный рецептор (TCR) или химерный антигенный рецептор (CAR), являются мощными инструментами для лечения злокачественных опухолей1. На сегодняшний день было одобрено несколько методов лечения гематологических заболеваний CAR T-клетками, а множество других проходят оценку в клинических испытаниях2. Во всех современных коммерческих продуктах используется доставка генов на основе вирусных векторов3. Хотя это хорошо зарекомендовавшая себя и относительно безопасная стратегия, она имеет некоторые существенные ограничения. Механически современные вирусные векторы полагаются на неконтролируемую полуслучайную интеграцию. Хотя безопасность вирусных векторов доказана растущим числом пациентов, получающих лечение продуктами CAR Т-клеток, а безопасность доставки вирусных генов признана учреждениями здравоохранения, неотъемлемый риск инсерционного мутагенеза остается нерешенной проблемой4,5,6. Поэтому производство Т-клеток следующего поколения направлено на использование более контролируемых методов редактирования генов, таких как CRISPR/Cas. CRISPR/Cas обеспечивает точную целевую интеграцию генов в заранее определенное место в геноме7. Это, в свою очередь, не только делает процедуру редактирования более точной, но и открывает возможность воспользоваться преимуществами сайта интеграции гена.

На сегодняшний день все клинически используемые кассеты генов CAR управляются сильными, конститутивно активными искусственными промоторами, перезаписывающими динамическую регуляцию транскрипции, которая происходит в физиологических условиях, с прямым влиянием на кинетику активации, фенотип и выживаемость8. Непрерывная экспрессия CAR может привести к истощению и субоптимальной функциональности CAR in vivo9. Технология CRISPR/Cas позволяет переносить гены ниже любого эндогенного промотора, тем самым уменьшая потребность в сконструированных или внешних промоторах и фокусируясь на более физиологических модификациях клеток8,10. Нативные промоторные области обеспечивают высокорегулируемую транскрипцию генов. Сложные паттерны последовательностей направляют регуляторные сигналы от дистальных энхансеров и связанных с ними модулирующих белков, что приводит к четкой транскрипции11. Сохранение сложной физиологической регуляции генов может помочь в создании дифференцированных клеточных продуктов. Было продемонстрировано, что лучшее нацеливание на CAR и сконструированные TCR приносит явные преимущества для эффективности и функции отредактированных Т-клеток за счет вставки искусственных генов под контролем эндогенных промоторов TCR, обеспечивая тем самым более физиологическую (транс-) экспрессию генов12.

Более того, хорошо продуманная стратегия редактирования может повысить точность убийств с помощью CAR. CAR Т-клетки очень эффективны в лизисе клеток, экспрессирующих целевой антиген (например, CD7, CD19 или BCMA), но они не различают здоровые и аномальные клетки13,14,15. Таким образом, после выполнения своей первоначальной задачи по уничтожению опухоли CAR Т-клетки продолжают атаковать все клетки, экспрессирующие родственный антиген16. Было предложено несколько подходов, позволяющих обойти эти целевые внеопухолевые побочные эффекты персистирующих CAR Т-клеток. Например, Т-клетки CAR могут быть уничтожены после полного уничтожения опухоли путем системного введения антител, направленных против синтетического «выключателя», коэкспрессируемого на Т-клетках CAR, что приводит к полному и стойкому восстановлению В-клеток17. Другим вариантом является временная экспрессия CAR на основе мРНК, которая перенаправляет Т-клетки против клеток-мишеней только до тех пор, пока мРНК системно поставляется18,19. Однако такие подходы сталкиваются с проблемами решения кинетики распределения, точности, пенетрантности и стойкости применяемых молекул.